Índice
Autoras
M. Yolanda Martín Pérez (Técnico Superior de Laboratorio Clínico y Biomédico)
Iris Barragán Martín (Bióloga)
Introducción
La PCR se ha convertido en algo muy popular tras la pandemia ya que es un método de detección directa de patógenos en la muestra clínica detectando su genoma. Para poder detectarlo primero hay que extraerlo de las muestras, dicho proceso se compone de tres fases: lisis, purificación y elución.
En la lisis se rompen las estructuras proteicas de la célula o las nucleocápsides víricas y se libera su contenido al medio. Luego se realiza una purificación en la que se tiene que retirar la mayoría de restos y componentes celulares que no sean el ácido nucleico. Los métodos más clásicos y manuales son el uso de disolventes orgánicos. También existen los métodos más complejos como los métodos de columnas, combina pases de la muestra por una columna que retiene los Ac nucleicos, se lava con etanol e isopropanol y, finalmente, se añade el buffer de elución que libera los ácidos nucleicos de la columna y se centrifuga.
Una forma de extraer y purificar de forma automática es mediante esferas magnéticas, en este método se añaden diferentes reactivos al concentrado de ácidos nucleicos y se añaden unas esferas de carga positiva, a las cuales los ácidos nucleicos se unirán mediante fuerzas electrostáticas al tener carga negativa. Posteriormente, mediante la aplicación de un campo magnético externo, los ácidos nucleicos se separan de las bolas magnéticas y se eluye para limpiar cualquier sustancia no deseada y obtener únicamente el ácido nucleico deseado. El medio de elución tiene que ser libre de RNAsas y DNAsas y en el que sea soluble.
Amplificación genómica PCR
El sustrato es DNA de doble cadena, en caso de ser un genoma de RNA este se convierte a cDNA mediante el uso de la retrotranscriptasa inversa (RT). Una vez se tiene DNA para poder realizar esta reacción, se añade el mismo a una solución con una serie de reactivos: una DNA polimerasa, desoxirribonucleótidos, una serie de sales entre las que es relevante el magnesio, los primers (secuencias de ADN en torno a 20 bases complementarias cada uno a una región de una de las hebras de ADN). Una vez mezclado todo se realizan ciclos de temperatura, consisten en tres fases:
- Desnaturalización: a 92-95 ºC para separar las hebras de DNA.
- Hibridación: temperatura óptima para que los primers hibriden con las hebras, 35-70ºC.
- Elongación: temperatura óptima para que trabaje la polimerasa, 68-72ºC
Estos ciclos se repiten hasta 40 veces. Al final se tienen que detectar los fragmentos que se han creado, esto se hace mediante electroforesis en gel de agarosa.
El diseño de los primers es probablemente la fase más crítica, ya que hay que elegir las secuencias que se quieren amplificar y seleccionar las mejores secuencias de alineación de los primers, que sean lo más específicas posibles para evitar que se hibriden con secuencias no deseadas que pudieran dar lugar a falsos positivos.
Los falsos positivos suelen ser raros, pero cuando ocurren es por una amplificación inesperada al hibridar los primers con secuencias no deseadas. Es algo raro que en una PCR se detecte contaminación, si la hay suele ser cruzada y se produce durante el proceso de preparación de las muestras. Los vehículos de contaminación suelen ser:
- El operario: el dedo pulgar puede tocar la parte interior del tapón y pasarlo a los siguientes tubos.
- El instrumental: pipetas, gradillas contaminadas, etc.
- El ambiente: si se generan aerosoles al abrir el tubo pueden quedar en el aire y contaminar el siguiente tubo.
Para obtener un mejor resultado evitando contaminaciones se tiene que valorar cual es el mejor método de extracción del genoma, ya que es el punto más crítico de contaminación. Con los métodos que requieren mucha manipulación habrá mayor posibilidad de contaminación que con aquellos que requieren menos manipulación. En general los métodos automáticos contaminan menos que los métodos manuales y cuanto más complejo sea el método de extracción más probable es que se contamine.
¿Cómo se detecta la contaminación?
Si es una contaminación generalizada se detecta mediante el uso de controles negativos, en éstos al no haber muestra no debería detectarse amplificación. Por lo que siempre es importante llevar a cabo buenas prácticas de laboratorio para evitar la contaminación:
- Ser cuidadoso y riguroso.
- Uso de puntas con barrera para aerosoles.
- Uso de guantes desechables.
- Trabajo en cabina de flujo laminar (evita aerosoles).
- Centrifugar siempre los tubos antes de abrirlos.
- Separación de zonas de trabajo: zona pre-PCR de mezcla de reactivos y una zona post-PCR donde se realizará la electroforesis. Cada zona debería estar dotada de equipamiento exclusivo de dicha zona.
Conclusiones
- La PCR es una buenísima opción a la hora de realizar una detección directa de patógenos.
- Existen varios métodos de extracción y purificación.
- El diseño de los primers es probablemente la fase más crítica.
- Los falsos positivos son raros, generalmente como consecuencia de contaminación cruzada durante la preparación de la muestra.
- Una contaminación generalizada se detecta mediante el uso de controles negativos.
- Es fundamental llevar a cabo buenas prácticas en el laboratorio para evitar contaminaciones.
Bibliografía
Asuar, L. E. (2007). Guía práctica sobre la técnica de PCR. Ecologia Molecular. LE Eguiarte, V. Souza, X. Aguirre (Eds). INECC. México, 517-552.
https://www.aisenbio.com/ noticias/cuales-son- los-metodos-habituales -de-extraccion-y- purificacion-de- acidos-nucleicos- que-se-utilizan-en-el-diagnostico -in-vitro/?lang=es