Autoras:
M Yolanda Martín Pérez (Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico y Biomédico) Iris Barragán Martín (Bióloga)
Introducción
La PCR es una técnica de uso muy frecuente hoy en día y existen distintas variantes para conseguir la amplificación de las cadenas de ADN dependiendo del tipo de estudio o de muestra a analizar, las cuales se detallan a continuación.
Variantes
La PCR anidada o nested PCR: es una variante en la que se realizan dos amplificaciones secuenciales con dos pares de primers distintos, es decir, la primera amplificación se utiliza de molde para la segunda. Este proceso permite aumentar la sensibilidad de la PCR ya que al usar dos pares de primers distintos permite aumentar el número de ciclos.
La PCR múltiple: se utiliza para realizar analíticas frente a diferentes secuencias en una sola reacción de PCR, siendo necesarios un par de primers específicos para cada secuencia que tengan y temperaturas de anillamiento similares.
La RT-PCR: consta de dos procesos consecutivos, primeramente ocurre una transcripción inversa, en la que la retrotranscriptasa inversa sintetiza ADN complementario de un molde de ARN, el cual será amplificado por la PCR correspondiente. Se utiliza para el diagnóstico de infecciones víricas y en el estudio de genes que se expresaban en el momento de estudio.
La PCR en tiempo real o cuantitativa (qPCR): la amplificación se va monitorizando en su transcurso, por lo que no hace falta añadir las muestras en un gel de agarosa para ver los resultados. Se utilizan los mismos reactivos y productos que en una PCR convencional, solamente que ya se venden en conjunto y se denomina “Master mix”. Para detectar los productos de la amplificación puede ser mediante dos métodos:
- Métodos no específicos: se usan moléculas intercalantes que se unen al ADN y por oxidación producen fluorescencia, la cual es capturada en cada ciclo y es proporcional al número de copias. Un ejemplo de estas moléculas es el SYBR Green.
- Métodos específicos: en éstos un donador fluorescente transfiere energía a un aceptor, pudiendo ser este proceso por hidrólisis o por hibridación. En el caso del método por hidrólisis se añaden sondas fluorescentes de oligonucleótidos con un donador y aceptor que se encuentran unidos hasta que la sonda hibrida con la secuencia de ADN, en este momento la polimerasa rompe la unión y emite fluorescencia que será detectada. Por el método de hibridación se añaden sondas con donadores y aceptores fluorescentes con espectros de emisión y excitación parecidos, por tanto, cuando la sonda se une a la secuencia diana, el donador se excita y transfiere la señal al aceptor, incrementando la fluorescencia a detectar.
Esta fluorescencia es capturada por el propio termociclador y por software se generarán las gráficas para analizar los datos. En las gráficas hay que destacar el punto umbral de detección o CT, a partir del cual se sobrepasa los niveles de fluorescencia de fondo, dando una idea de la cantidad de amplicón que hay en la muestra. Por tanto, a menor CT mayor amplicón en la muestra y menor número de ciclos serán necesarios para detectarlo.
La PCR in situ o hibridación in situ de PCR: es una técnica que combina la PCR con la hibridación in situ que permite amplificar en células secuencias específicas de ADN o ARN. Esta técnica puede realizarse de forma directa, donde se incorpora un nucleótido marcado al hacer la PCR, o de forma indirecta donde primero se realiza una amplificación in situ y posteriormente se realiza una hibridación in situ mediante una sonda de oligonucleótidos marcada. Primeramente se pretrata el tejido, generalmente se trata con paraformaldehído y se fija con formalina. Posteriormente se digiere con una proteasa que permite que los reactivos penetren en el tejido, permitiendo que se realice una PCR de unos 20-30 ciclos, que en caso de ser in situ directa se deben añadir marcado uno de los cuatro desoxinucleótidos. En el caso de querer amplificar ARN, deberá añadirse la retrotranscriptasa inversa. Después de la amplificación, se inmoviliza la muestra con paraformaldehído. La amplificación por PCR in situ indirecta se detecta mediante hibridación in situ fluorescente y la amplificación por PCR in situ directa se detecta mediante inmunohistoquímica.
Conclusiones
La elección de la técnica a utilizar en el laboratorio clínico o de investigación para la obtención de ADN mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa, es primordial a la hora de conseguir llegar a un diagnóstico clínico certero. Dentro de la variedad existente, es imprescindible decantarse por la opción más adecuada para cada caso y determinación, por ello es fundamental poseer los conocimientos y los medios necesarios para tomar la decisión adecuada a la hora de realizar el proceso.
Bibliografía
Bolivar, A. M., Rojas, A., & Lugo, P. G. (2014). PCR y PCR-Múltiple: parámetros críticos y protocolo de estandarización. Avances en biomedicina, 3(1), 25-33.
Green, M. R., & Sambrook, J. (2019). Nested polymerase chain reaction (PCR). Cold Spring Harbor Protocols, 2019(2), pdb-prot095182.
Jin, L., & Lloyd, R. V. (1997). In situ hybridization: methods and applications. Journal of clinical laboratory analysis, 11(1), 2-9.
Moraleda, B. J., Martin, M. J. F., Belloso, M. S., Gómez, M. L., Molinos, A. C. M., & Negru, G. C. (2021). Diagnóstico y tipos de PCR. Revisión bibliográfica. Revista Sanitaria de Investigación, 2(8), 125.
Tamay de Dios, L., Ibarra, C., & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en discapacidad, 2(2), 70-78.